Practica de laboratorio - Extracción de ADN de hígados de pollo
Objetivo:
El objetivo fundamental de esta
práctica es utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un
tejido animal y, por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar.
A partir de la longitud enorme de las fibras también se confirma que en el
núcleo el ADN se encuentra replegado.
Introducción:
La cromatina es el conjunto de
ADN, histonas y proteínas no histónicas que se encuentran en el núcleo de las
células eucariotas y que constituye el genoma de dichas células. El ADN lo aisló por primera vez,
durante el invierno de 1869, el médico suizo Friedrich Miescher mientras
trabajaba en la Universidad de Tubinga. Miescher realizaba experimentos acerca
de la composición química del pus de vendas quirúrgicas desechadas cuando notó
un precipitado de una sustancia desconocida que caracterizó químicamente más
tarde. Lo llamó nucleína, debido a que lo había extraído a partir de núcleos
celulares. Se necesitaron casi 70 años de investigación para poder identificar
los componentes y la estructura de los ácidos nucleicos.
El ADN se encuentra en el
interior del núcleo celular, disperso y muy replegado, unido a proteínas para
formar la cromatina.
Así, para extraerlo será
necesario homogeneizar el tejido y romper las células para separar el núcleo,
romper también la envoltura nuclear para liberar su contenido, luego separar el
ADN de las proteínas que lo protegen y, por último, precipitarlo para extraerlo
de la solución.
Una vez realizado esto, el ADN
aparecerá como un agregado de fibras blanquecinas que se adhieren a la varilla
de vidrio. Por último, se puede situar sobre un portal, teñirlo con un
colorante básico y observarlo al microscopio.
Materiales:
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Hígado de pollo
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Varilla de vidrio
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Alcohol de 96:
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Cloruro sódico 2M
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SDS (nosotros utilizamos detergente)
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Arena
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Trocito de tela para filtrar
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Eosina
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Mortero
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Vasos de precipitado
·
Pipeta
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Probeta
Procedimiento:
1. Triturar
medio higadito de pollo en un mortero. Añadir una cucharadita arena para que al
triturar se puedan romper las membranas y queden los núcleos sueltos.
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| Higado de pollo triturado. |
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| Higado de pollo en el mortero. |
2. Añadir al
triturado, 20 ml de agua. Remover hasta hacer una especie de papilla o puré.
3. Filtrar
varias veces en una probeta sobre una tela para separar los restos de tejidos
que hayan quedado por romper.
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| Filtrado del hígado de pollo utilizando un pedazo de tela. |
4. Medir el
volumen del filtrado final con una probeta.
5. Añadir al
filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos producir
el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.
Verterlo todo en un vaso de precipitado.
6. A
continuación se añade 1 ml de SDS. La acción de este detergente es formar un
complejo con las proteínas y separarlas del ADN. Así nos quedará el ADN libre
de las proteínas que tiene asociadas.
7. Añadir
mediante una pipeta ( o probeta) 25-50 centímetros cúbicos de alcohol de 96:.
Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se
formen dos capas. En la interface, precipita el ADN. Importante inclinar el
vaso de precipitado para evitar el contacto directo y asegurarnos el resbale.
8. Introducir
una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla
se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el
resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.
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| Resultado al remover con la varilla de vidrio |
9. Tomar una
pequeña muestra de las fibras y teñir con eosina, añadiendo una gota del
colorante y dejándolo reposar durante 10 minutos. Observar al microscopio. Se
pueden conseguir resultados similares utilizando azul de metileno y esperando
1-3 minutos.
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ADN del higado de pollo en el
microscopio. |
Preguntas:
1.- ¿De qué
está formada la cromatina?
2.- ¿Para
qué añadimos arena al triturado?
3.- ¿Por qué
crees que estallan los núcleos al añadir el cloruro sódico?
4.- ¿Qué
acción tiene el SDS sobre la cromatina?
5.- Realiza un
dibujo de la observación de las fibras al microscopio.
